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DISCOTECA

Jan 14, 2024Jan 14, 2024

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 12383 (2023) Citare questo articolo

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Gli sferoidi tumorali multicellulari incorporati in matrici di collagene I sono comuni sistemi in vitro per lo studio di tumori solidi che riflettono l'ambiente fisiologico e le complessità dell'ambiente in vivo. Sebbene gli ambienti del collagene I siano fisiologicamente rilevanti e permissivi nei confronti dell'invasione cellulare, lo studio degli sferoidi in tali idrogel presenta sfide per i test analitici chiave e per un'ampia gamma di modalità di imaging. Sebbene ciò sia in gran parte dovuto allo spessore degli idrogel 3D che in altri campioni può essere tipicamente superato mediante sezionamento, a causa della loro natura altamente porosa, gli idrogel di collagene I sono molto difficili da sezionare, soprattutto in modo da preservare la rete di idrogel comprese le cellule modelli di invasione. Qui, descriviamo un nuovo metodo per preparare e criosezionare sferoidi invasivi in ​​una matrice bicomponente (collagene I e gelatina), una tecnica che chiamiamo criosezione sferoidale in vitro a doppio idrogel di campioni tridimensionali (DISC-3D). DISC-3D non richiede fissazione cellulare, preserva l'architettura degli sferoidi invasivi e dei loro dintorni, elimina le sfide dell'imaging e consente l'uso di tecniche che sono state applicate raramente nell'analisi degli sferoidi tridimensionali, tra cui la microscopia a super risoluzione e l'imaging con spettrometria di massa .

Lo studio in vitro di cellule coltivate su substrati piatti e bidimensionali (2D) è stato impiegato per oltre un secolo ed è stato cruciale in innumerevoli scoperte scientifiche. Sebbene la coltura cellulare 2D continui a essere un metodo standard nella biologia molecolare e cellulare, è stato a lungo apprezzato il fatto che non può ricapitolare gli aspetti critici dei sistemi in vivo, comprese le interazioni cellula-cellula tridimensionale (3D) e cellula-ambiente1. Tali interazioni sono particolarmente importanti nello studio dei processi cellulari che sono esplicitamente emergenti e multicellulari; per esempio, nello sviluppo e nella crescita e progressione del tumore solido.

Negli ultimi anni, la coltura cellulare 3D è stata sempre più utilizzata2. Qui, le entità multicellulari vengono coltivate o preparate da linee cellulari o tessuti del paziente – tipicamente chiamati rispettivamente sferoidi e organoidi – e coltivate in idrogel sintetici o naturali che imitano la matrice extracellulare in vivo. È stato dimostrato che la coltura cellulare tridimensionale replica meglio la fisiologia del tessuto umano, come i gradienti di nutrienti e ossigeno, le diverse zone proliferative e le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice, fornendo una chiara motivazione per l'utilizzo della coltura 3D per studiare questioni biologiche che sono di natura multicellulare3,4,5,6. Tra gli idrogel 3D, gli ambienti di collagene I mostrano particolare rilevanza fisiologica per molti tumori solidi. Nel cancro al seno, un'elevata densità di collagene I è un noto fattore di rischio per lo sviluppo della malattia7,8 e la particolare densità e l'organizzazione aerea delle fibre di collagene attorno ai tumori sono associate alla prognosi9. Le interazioni tra le cellule e il microambiente stromale ricco di collagene sono importanti anche nel cancro del pancreas10,11 e sono state implicate in una varietà di altri tumori12. Il collagene I è anche un ambiente attraente per la coltura cellulare 3D poiché la sua biochimica e la struttura di rete supportano un'efficiente invasione cellulare. Inoltre, è un ambiente in cui le proprietà fisiche, come la larghezza delle fibre, la dimensione dei pori e la rigidità dell'idrogel, possono essere facilmente regolate senza alterare la composizione biochimica, consentendo lo studio degli effetti di queste proprietà sulla modalità invasiva e sull'efficienza cellulare13,14,15,16 .

Nonostante sia ben noto che la coltura cellulare 3D, e gli idrogel di collagene I in particolare, forniscono un alto grado di rilevanza fisiologica e opportunità per distinguere l’importanza della biochimica dalle proprietà fisiche sul comportamento cellulare, l’adozione della coltura cellulare 3D è stata relativamente lento. La riluttanza deriva, in parte, dalle sfide associate all'acquisizione di immagini al microscopio ottico ad alta risoluzione in tali ambienti6. Le cellule percepiscono e rispondono alla rigidità ambientale su distanze di almeno decine di micron e probabilmente ben superiori a cento17. Pertanto, affinché le cellule si comportino come farebbero in un ambiente 3D isotropo, devono essere posizionate ben al di sopra dei substrati rigidi di imaging. Ciò può comportare che le cellule si trovino oltre la distanza di lavoro dei tipici obiettivi ad alta apertura numerica, un segnale di fondo elevato dovuto alla dispersione dall'esterno del piano di imaging e l'autofluorescenza delle cellule o dell'idrogel che circonda le cellule. Inoltre, l’ambiente 3D può ostacolare la diffusione di piccole molecole o anticorpi attraverso il campione, inibendo sia gli studi sui farmaci che l’introduzione di etichette fluorescenti in questi contesti. Le sfide associate ai campioni 3D possono essere particolarmente acute negli approcci più ricchi di informazioni come l'imaging ottico a super risoluzione, dove un rapporto rapporto rumore elevato è fondamentale, negli approcci correlativi in ​​cui vengono impiegate più modalità e negli approcci non ottici come la spettrometria di massa imaging in cui la dispersione da campioni spessi preclude la raccolta dei dati tranne che sulla superficie del campione.

 0.05 (n = 12, 59, and 46 slices for 3D, DISC-3D, and DISC-3D re-stained, respectively)./p> 0.05./p> 100 μm into the gel [3D high], and (bottom) following DISC-3D preparation (4 μm slices). From left to right, the columns show images taken using widefield microscopy, confocal microscopy, Airyscan imaging, lattice SIM, and STORM in a HILO implementation. No image is presented for 3D STORM imaging in the top two rows because (3D low) filtering out-of-plane light was insufficient or (3D high) the technique could not be implemented at such depths. Scale bar = 20 μm. (b) Mean measured full width at half maximum (FWHM) of collagen fibers from each microscopy technique. Error bars show standard deviation. Expected minimum FWHM of each approach is shown via dashed horizontal lines. (c) Pore size of collagen networks determined across imaging techniques and sample preparations (see Methods for details). Error bars show standard deviation. Statistical significance, number of samples assessed, and additional information about resolution of each technique are provided in Fig. S4./p> 100 μm into the gel, referred to as 3D high, middle row), and following DISC-3D preparation and cryosectioning (bottom row). All gels investigated were subjected to the first portion of the DISC-3D protocol, the addition and gelation of gelatin. Thus, the only difference between the samples in the DISC-3D images (bottom row) and the other samples (top and middle rows) is that the DISC-3D samples were frozen, removed from the sample wells, and sectioned. First, we note that qualitatively, images of the hydrogel collected near the coverslip appear similar to images of DISC-3D samples across techniques, suggesting that hydrogel structure is not adversely affected by the DISC-3D sample preparation procedure. Generally, DISC-3D samples show enhancements in image quality for all microscopy techniques explored. Widefield microscopy, which suffers from out of plane signal for 3D samples, shows obvious gains in image quality for DISC-3D samples relative to intact 3D samples (Fig. 4a, leftmost column). Confocal microscopy, Airyscan, and SIM, while providing excellent image quality and revealing consistent fiber morphology low in the gel, also show declines in image quality at increased imaging depths (Fig. 4a). We note that imaging at such depths assures the cells interrogated do not sense the underlying stiff substrate; therefore, maximizing image quality in this region is critical for studying cell behavior in a physiologically relevant context. STORM images were poor, and fibers were difficult to discern both low and high in the 3D gels, ostensibly due to challenges filtering out of plane emission in this highly scattering sample, as such filtering is critical to identification and localization of single fluorophores. The enhancement in image quality observed for DISC-3D samples opens the door to revealing details about system microstructure that would not otherwise be accessible in traditional 3D culture contexts./p> 0.95, Fig. S4a). For most microscopy techniques explored here, we find fiber widths larger than the expected fiber thickness of 50–100 nm, consistent with the measured resolutions of these techniques (Fig. 4, Fig. S4c). Given that the true fiber width falls below measured resolutions for widefield, confocal, Airyscan, and SIM, only STORM imaging—which can only be applied to DISC-3D samples—can accurately report fiber thickness (Fig. 4b). Here, we find a fiber width of approximately 75 nm in DISC-3D samples, in good agreement with measurements by electron microscopy and atomic force microscopy46./p> 0.05. (d,e) Representative normalized mass spectra collected from invasive spheroids following the DISC-3D protocol at (d) 24 °C and (e) 350 °C demonstrating the increase in signal intensity in the ≈ 650–900 m/z regime. Number at right on each panel indicates maximum intensity peak at that temperature. (f) Representative mass spectrometry images prepared following the DISC-3D protocol outlined in Fig. S1d, showing consecutive sections of single spheroids for several signal ions. In the first serial section of each signal ion, the spheroid core is marked by a white dotted line and the invasive front is denoted by a red dotted line. Color scale from minimum to maximum intensity is shown for signal ions at right. Scale bar = 500 μm./p> 100 photons) and standard deviation of the fitted Gaussian (> 50 nm and < 250 nm) to remove noise and poor-quality fits. Noise was further reduced by using a DBSCAN-based filter to remove outlier molecules in sparsely populated regions of the imaging area (Epsilon = 50 nm, MinPts = 5). After these post-processing steps, images were drift-corrected using cross-correlation with a bin size of 5. Molecules in post-processed and drift-corrected images were visualized using the “Normalized Gaussian” rendering with a lateral uncertainty set to 10 nm./p> 0.05) is denoted by a dagger (†). A denotes statistical significance and is described in the relevant figure caption when employed./p>

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